Kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis

 I.       Judul percobaan

“Kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis”

II.    Tujuan percobaan

Pada akhir percobaan mahasiswa harus mengerti mengenai:

1.      Teknik-teknik dasar kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis

2.      Prinsip dasar dari kromatografi

3.      Prinsip dasar dari pengaruh substituent terhadap substitusi elektrofil pada senyawa aromatik

III. Landasan Teori

        Kromatografi pertama kali diperkenalkan oleh Michael Tswet, (1906) seorang (ahli botani dari Rusia. Dalam percobaannya, ia berhasil memisahkan klorofil dan pigmen. Pigmen warna lain dari ekstrak tumbuham dengan menggunakan serbuk kalsium karbonat yang diisikan kedalam kolom kaca dan petroleum eter sebagai pelarut. Proses pemisahan itu diawali dengan menempatkan larutan cuplikan pada permukaan atas kalsium karbonat, kemudian dialirkan pelarut petroleum eter. Hasilnya berupa pita-pita berwarna yang terlihat sepanjang kolom sebagai hasil pemisahan komponen-komponen dalam ekstrak tumbuhan. Dari pita-pita berwarna tersebut muncul istilah kromatografi yang berasal dari kata “Chroma” dan “Graphein”. Dalam bahasa yunani kedua kata tersebut berarti “Warna” dan “Menulis” (Soebagio,2000:54).

        Kromatografi adalah prinsip pemisaham campuran senyawa atas komponen-komponen berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi masing-masing komponen diantara dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Perbedaan kromatografidahan tersebut dapat disebabkan oleh perbedaan kemampuan masing-masing komponen untuk diserap (adsorpsi) atau perbedaan distribusi diantara dua fasa yang  tidak saling bercampur (partisi) (Tim Dosen, 2012:39).

               Pengertian kromatografi menyangkut metode pemisahanyang didasarkan atas distribusi diferensial komponen sampel diantara dua fasa. Menurut pengertian ini kromatografi selalu melibatkan dua fasa, yaitu fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam dapat berupa cairan yang terikat pada permukaan padatan (kertas atau suatu adsorben) sedangkan fasa gerak dapat berupa cairan eluen atau pelarut atau gas pembawa yang inert (Soebagio,2000:54).

     Pemisahan yang terjadi dalam kromatografi dilaksanakan dengan memanipulasi sedemikian rupa sifat-sifat fisik umum dari suatu senyawa atau molekul, yaitu:

a.   Kecenderungan suatu molekul untuk larut dalam cairan ( kelarutan)

b. Kecenderungan suatu molekul untuk berkait dengan sutu serbuk bahan padat (absorbsi)

c .Kecenderungan suatu molekul untuk menguap (volatilitas).

   Dalam kromatografi, senyawa yang akan dipisahkan ditempatkan pada situasi dinamik (bergerak) yaitu dengan melakukan pengaliran dan selama itu akan terjadi peristiwa pelarutan absorbsi atau penguapan (Slamet,1989:43).

             Menurut Asyhar (2012), ada lima macam kromatografi, yaitu:

1.Kromatografi lapis tipis                                                                                                                 

Merupakan kromatografi yang menggunakan lempeng gelas atau aluminium yang dilapisi dengan lapisan tipis alumina, silica gel, atau bahan serbuk lainnya.

2.Kromatografi penukar ion

Merupakan bidanigunakan untuk  khusus kromatografi cairan-cairan seperti namanya, system ini khusus digunakan untuk spesies ion

3.Kromatografi penyaringan gel

Merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari modifikasi dekstran molekul polisakarida linear yang mempunyai akatan silang

4.Elektroforesis

Merupakan kromatografi yang diberi medan listrik disisinya dan tegak lurus aliran fasa gerak

5.Kromatografi kertas

Merupakan kromatografi cairan-cairan dimana sebagai fasa diam  adalah lapisan tipis air yang diserap dari lembab udara oleh kertas jenis fasa cair laiinnya dapat digunakan.

            Kromatografi kolom merupakan teknik kromatografi yang paling awal ditemukan dari mekanismenya, kromatografi kolom merupakan terapan atau absobsi yang tidak boleh larut dalam fasa gerak, ukuran partikel fasa diam harus seragam.  Zat pengotor yang terdapat pada  fasa diam dapat menyebabkan absobsi tidak reversible sebagai fasa diam digunakan alumina, silica gel, arang, bauksit, magnesium karbonat, kalsium karbonat, talk, pati, sekelator, gula dan tanah diatom.Fasa gerak pada kromatografi kolom dapat  berupa pelarut tunggal atau campuran beberapa pelarut polar dan nonpolar. Umumnya senyawa nonpolar dengan  berat molekul lebih cepat meninggalkan fasa diam (Soebagio,2000:81-82).

             Kromatografi kolom bertujuan untuk mengisolasi komponen kurkumin dari campurannya. Pada kromatografi kolom ini digunakan kolom dengan adsorben silica gel karena kolom yang dibentukdengan silica gel memiliki tekstur dan struktur yang lebih kompak dan teratur. silika gel dalam bentuk tetrahedral raksasa, sehingga ikatannya kuat dan rapat. Dengan demikian, adsorben silica gel mampu menghasilkan proses pemisahan yang lebih optimal (Asyhar,2012:diakses pada tanggal 26 april 2012).

            Kromatografi lapisan tipis atau TLC seperti halnya kromatografi kertas, murah dan mudah dilakukan. Kromatografi ini mempunyai  satu keunggulan dari segi kecepatan dari kromatografi kertas. Proses kromatografi lapisan tipis membutuhkan hanya setengah jam saja, sedangkan pemisahan yang umum pada kertas membutuhkan waktu beberapa jam. TLC sangat terkenal dan rutin digunakan diberbagai laboratorium. Media pemisahannya adalah lapisan dengan ketebalan sekitar 0.1 sampai 0.3mm zat padat adsorben pada lempeng kaca, plastik atau aluminium. lempeng yang paling umum digunakan berukuran delapan kali dua inci dan zat padat yang umum digunakan adalah alumina, gel silica dan selulosa (R.A.Day,JR,2002:551-552).

             Perhitungan nilai Rf berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang ditempuh oleh bercak warna masina-masing. Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan  rumus sebagai berikut:

Rf =  

IV. Metode

A.    Alat dan Bahan

1.      Alat

a.       Erlenmeyer 50 ml 6 buah

b.      Pipa kapiler

c.       Kolom gelas

d.      Pelat KLT

e.       Botol elusi

f.       Botol semprot

g.      Botol uap iodium

h.      Gelas ukur 

i.        Spiritus, kaki tiga, kasa

j.        Statif dan Klem

k.      Corong pisah

l.        Pipet tetes

m.    Termometer

2.      Bahan

a.       Kapas

b.      Silica gel TLC

c.       Kristal iod

d.      Asam nitrat pekat

e.       Ekstrak batang daun bambu

f.       Benzena

g.      Kloroforn

h.      Aquades

B.     Cara kerja

1.      Pembuatan kromatografi kolom

a.       Menyiapkan kolom gelas yang berisi penyumbat kapas pada ujungnya

b.      Memasukkan kloroform ke dalam kolom sampai setengahnya

c.       Memasukkan campuran silica gel dan ekstrak batang daun bambu kedalam kolom yang telah diisi kloroform sebelumnya dan membiarkannya menetes 

d.      Menampung fraksi-fraksi tetesan yang keluar dari kolom gelas

e.       Mengganti gelas ukur setiap 20 ml sebanyak 6 kali

f.       Mengumpulkan fraksi

2.      Pemeriksaan lapis tipis

a.  Mengambil satu per satu fraksi, mulai dari gelas pertama sampai keenam, kemudian menotolkan fraksi pada plat tipis silica gel

b.      Memasukkan plat lapis tipis silica gel kedalam botol eluen berisi benzena

c.       Meneteskan noda awal, lalu mengambil plat tersebut dan mengeringkan di udara

d.      Menyimpan plat kedalam botol berisi uap iodium

e.       Menentukan harga Rf dari noda-noda yang diperoleh.

V.    Hasil Pengamatan

     Silica gel, kloroform dan ekstrak batang daun bambu dimasukkan kedalam kolom gelas, terbentuk serbuk berwarna hijau tua kemudian menambahkan silica gel, kloroform dan serbuk yang dibuat sebelumnya kedalam kolom gelas, terjadi perubahan warna dan terbentuk 2 lapisan, dimana lapisan bawah adalah silica gel yang berwarna putih dan lapisan atas berwarna hijau tua. Tetesan fraksi-fraksi eluen yang keluar dari kolom gelas ditampung hingga 20 ml dan tetesan tersebut berwarna hijau kehitam-hitaman. Kemudian ditambahkan lagi kloroform 10 ml kedalam kolom gelas lalu gelas ukur atau penampung diganti yamg lain, larutan yang dihasilkan berwarna hijau lebih muda dari hasil pertama. Hasil fraksi dari masing-masing penampung ditotolkan pada pelat lapis tipis yaitu pada garis yang telah dibuat sebelumnya. Kemudian pelat tersebut dimasukkan kedalam bottas bol eluen yang telah berisi benzene dan mengukur garis pada pelat 0,5 cm dari batas bawah pelat dan 4 cm dari garis bagian bawah yang telah dibuat, larutan benzene mengalami penyerapan pada pelat lapis tipis hingga sebelum sampai tepat pada garis 4 cm. kemudian iod dipanaskan dalam gelas kimia, menghasilkan uap berwarna ungu. Gelas kimia yang berisi uap berwarna ungu, dimasukkan plat kedalamnya, sehingga warna masing-masing noda semakin jelas dari warna kekuning-kuningan hingga kemerah- merahan. Adapun batas noda(Rf) untuk setiap noda:

a.    Fraksi 1       :     noda 1 Rfnya 0,125 cm

b.    Fraksi 2       :     noda 1 Rfnya 0,175 cm

c.     Fraksi 3      :  - noda 1 Rfnya 0,125 cm

                    -  noda 2  Rfnya   0,125 cm

VI. Analisis data

1.         Fraksi 1

Noda 1 Rf =  

                           =  = 0,125 cm

2.        Fraksi 2

Noda 1 Rf = 

                           =  = 0,175 cm

3.        Fraksi 3

Noda 1 Rf = 

                           =  = 0,125 cm

Noda 2  Rf = 

                           =  = 0,125 cm

VII Pembahasan

1.      Pembuatan Kromatografi Kolom

Pada percobaan ini, campuran serbuk yang dibuat sebelumnya dimasukkan kedalam kolom yang telah berisi penyumbat gabus, yang telah dimasukkan ekstraknya terlebih dahulu, silica gel dan kloroform. Kemudian dielusi lagi dengan kloroform sampai adanya fraksi, dimana masing-masing fraksi mengandung satu komponen yang identitasnya ditentukan dengan kromatografi lapis tipis. Peralatan kromatografi sangat sederhana. Kolom dilengkapi dengan kran untuk mengatur aliran pelarut dan penyumbat kapas untuk menahan fase diam. Fase diamnya yaitu silica gel dan fase geraknya kloroform.

Dalam pelaksanaan pemisahan dengan teknik ini, pertama-tama campuran diletakkan dibagian atas kolom yang berisi fase diam. Fase gerak kemudian dialirkan pelan-pelan dan dibiarkan mengalir melalui kolom tersebut. Pada saat bergerak, fase gerak membawa campuran kebawah. Karena setiap komponen dalam campuran mempunyai koefisien distribusi yang berbeda, maka kecepatan migrasinya juga berbeda. Perbedaan kecepatan inilah yang menyebabkan terjadinya pemisahan komponen dalam campuran. Kemudian pelarut yang menetes atau eluen keluar dari kolom dan ditampung fraksinya. Komponen pertama keluar dari kolom adalah komponen kurang polar, karena silica berikatan lebih erat dengan senyawa polar, Sehingga senyawa polarnya lama berada dalam kolom. Pelarut yang lebih polar  membawa senyawa yang kurang polar lebih cepat melintasi kolom, karena senyawa tersebut kurang berinteraksi dengan fase yang polar dan hanya berada dalam kolom untuk waktu yang berbeda-beda.   

2. Pemeriksaan Lapis Tipis

 Berdasarkan percobaan, fraksi-fraksi yang diperoleh ditotolkan pada plat lapis tipis, kemudian dimasukkan kedalam botol eluen yang berisi benzene. Noda mulai bergerak sedikit demi sedikit keatas. Dari hasil pengamatan yang diperoleh, komponen yang menempuh jarak lebih jauh bersifat nonpolar dibanding dengan senyawa polar. Adapun Rfnya adalah:

a.     Fraksi 1       :     noda 1 Rfnya 0,125 cm

b.     Fraksi 2       :     noda 1 Rfnya 0,175 cm

c.     Fraksi 3       :  - noda 1 Rfnya 0,125 cm

                    -  noda 2  Rfnya   0,125 cm

VIII.       Kesimpulan dan saran

1.      Kesimpulan

a.       Kromatografi adalah prinsip pemisahan campuran senyawa komponen-komponen berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi masing-masing komponen diantara dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak

b.      Pemisahan dalam hal ini yang dilakukan adalah kromatigrafi kolom dan kromatografi lapis tipis

c.       Prinsip kerja kromatografi adalah pemisahan campuran senyawa atas komponen berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi masing-masing fasa..

2.      Saran

a.       Sebaiknya praktikan mempelajari dan memahami teori sebelum praktikum

b.      Sebaiknya praktikan memperhatikan petunjuk yang diberikan oleh asiaten agar hasil yang diperoleh sesuai yang diinginkan

DAFTAR PUSTAKA

Arsyar. 2010. Kromatografi kolom dan lapis tipis  (http://arsyharst08.wodpress.com). Diakses pada tanggal 26 april 2012.  

Clark, Jim. 2007. Kromatografi lapis tipis (http://www. Chem-is-Try Org). Diakses pada tanggal 26 april 2012.

Soebagio, dkk. 2000. Kimia Analitik II.Malang: JICA.

Sudarmadji, Slamet, dkk.1989. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian

.            Liberti: Yogyakarta.

Tim Dosen Kimia Organik. 2012. Penuntun Praktikum Kimia Organik 1. Makassar:  Universitas Negeri Makassar.

Underwood,A.L,dkk. 2002. Analitik Kimia Kuantitatif. Edisi keenam. Jakarta: Erlangga.

JAWABAN PERTANYAAN

1.      Urutan kepolaran fraksi fenol dengan memperhatikan nilai  Rfnya maka yang paling polar adalah o- nitro fenol dengan harga Rf yang paling tinggi

2.       Salah satu Saran untuk memperoleh senyawa murni adalah melalui teknik penggunaan kromatografi adalah pelarut-pelarut yang digunakan sebaiknya mempunyai kemurnian yang tinggi karena terdapatnya sedikit zat pengat laiinya dapat menghasilkan kromatografi yang tidak diinginkan.